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更新時間：2024-10-30
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自2013年歐盟全面禁止化妝品動物實驗以來，體外重建皮膚模型已廣泛應用于藥物和化妝品功效研究及毒理評價。然而，現有的體外皮膚模型在模擬皮膚功能方面，尤其在血管化重建方面，仍存在顯著不足，這導致難以實現組織區域的有效灌注。
摩方精密圣地亞哥研究院團隊開發了一種全新的三維可灌注血管化皮膚芯片，采用了摩方精密的面投影微立體光刻（PμSL）技術，精確構建仿生微毛細血管網絡系統。該皮膚芯片在營養供給、增強屏障功能和維持組織活性方面表現優異，與傳統的內皮細胞自組裝或犧牲材料方法相比，該模型簡化了操作流程并提高了實驗的可重復性。通過石蠟切片、蘇木精-伊紅（H&E）染色和免疫熒光標記方法，驗證了芯片中的真皮層和表皮層的完整結構。
這一研究成果以“Full-Thickness Perfused Skin-on-a-Chip with In Vivo-Like Drug Response for Drug and Cosmetics Testing "為題，發表在《Bioengineering》上。摩方精密圣地亞哥研究院的Stephen Rhee為論文第一作者，孫冰潔博士為通訊作者。
此外，該芯片支持高通量測試，其定制化夾具支持在多孔板中同時進行多個芯片的灌注實驗。通過使用TNF-α誘導炎癥及地塞米松的抗炎治療，摩方研究團隊將該芯片與傳統2D培養和人類皮膚活檢樣本進行了對比。結果表明，皮膚芯片與人類皮膚的藥物反應趨勢一致，且在長期培養中表現出更低的細胞毒性。
這一灌注皮膚芯片為藥物和化妝品篩選提供了一個高度仿生的體外模型，顯著提高了實驗的生理相關性。
通過PμSL 3D打印技術（microArch® S230，精度：2微米），摩方研究團隊成功地在芯片中構建了仿生微毛細血管網絡系統。該系統中，每個中空的微通道表面均勻分布有7微米的開放微孔，微通道內可以灌輸細胞培養基，使得營養物質和氧氣能夠從通道內均勻擴散至管道外的細胞培養區域。同時，灌輸系統可有效排出代謝廢物，從而確保細胞的健康生長和組織的長期活性。微通道貫穿整個皮膚組織，保證了培養基在組織內的均勻供給。
為了提高皮膚芯片的功能性和操作便捷性，摩方研究團隊設計了定制化芯片夾具，確保皮膚芯片能夠精確放置，并與標準的6孔板兼容。夾具蓋的設計可提供穩定的氣液界面，這對于皮膚模型的全面仿生功能化至關重要。（圖1展示了皮膚芯片與夾具的設計細節，圖2展示了灌注系統的設置和操作流程。）
圖1. 皮膚芯片與夾具示意圖。(a，b) 皮膚芯片的俯視圖與正視圖，顯示微通道的布局及內部結構；(c) 微孔的掃描電鏡（SEM）圖像，比例尺：200微米；(d) 放大后的SEM圖像，展示單個微孔，比例尺：20微米；(e) 皮膚芯片與夾具組裝前的圖像；(f) 皮膚芯片裝入夾具后的側視圖；(g) 六個皮膚芯片及夾具放置于六孔板中的圖像。
圖2. 皮膚芯片灌注系統的設置與操作流程，通過簡單的三步流程即可輕松實現穩定灌注。(1) 將皮膚芯片放入夾具中；(2) 將夾具插入六孔板并固定蓋子；(3) 連接灌注系統的入口和出口端口并啟動灌注。灌注系統通過管道連接入口與出口，入口管道連接裝有培養基的注射器，并與雙向注射泵相連；出口管道連接空注射器以收集廢液，同樣連接到雙向注射泵。
研究團隊使用熒光小分子溶液進行灌注測試，監測流體在芯片中的流動與擴散情況。熒光溶液以10微升/分鐘的速度注入微通道，熒光分子均勻擴散并充滿芯片，整塊芯片中的熒光強度隨之而逐漸增加（圖3a-b）。雖然PDMS常用于傳統器官芯片系統，但其對小分子的吸收會影響藥物測試的準確性。因此，研究團隊對芯片使用的BIO材料進行了小分子藥物的吸收測試，將五種FDA批準的小分子藥物與BIO材料孵育24小時并和對照組對比，通過高效液相色譜法（HPLC）進行分析。結果表明，BIO材料中的藥物濃度與對照組無顯著差異，證明該材料不會吸收小分子（圖3c）。
圖3. 皮膚芯片系統中小分子擴散與吸收的驗證(a) 灌注后微通道中熒光小分子擴散到芯片中的時間序列圖像，比例尺：1毫米；(b) 灌注后芯片內熒光強度的變化圖；(c) 孵育BIO材料24小時后藥物溶液中小分子藥物的濃度。
為了模擬體內皮膚環境，研究團隊在皮膚芯片上成功重建了表皮層和真皮層。真皮層由成纖維細胞與I型膠原蛋白水凝膠構成，表皮層則由種植在真皮層上的角質形成細胞組成。真皮層被種植在微通道周圍，確保灌注系統能夠有效地為皮膚組織提供營養供應。石蠟切片與蘇木精-伊紅（H&E）染色結果顯示，本研究構建的皮膚模型具有清晰的表皮和真皮結構，且角質形成細胞向真皮層的遷移極少（圖4）。
通過免疫染色，研究團隊使用共聚焦顯微鏡確認了皮膚模型的組織形態。表皮層中角蛋白10（CK10）的表達和基底層中角蛋白14（CK14）的表達驗證了表皮層的均勻性和結構完整性（圖5a）。此外，真皮層中的成纖維細胞形態以及I型和IV型膠原蛋白的表達也得到了清晰的展示（圖5b, c）。表皮層還觀察到了分化標記物外皮蛋白（involucrin）和絲聚合蛋白(filaggrin)的表達（圖5d, e）。
圖4. 皮膚芯片中皮膚組織結構及形成的示意圖。(a) 體內皮膚結構與芯片皮膚結構的對比，角質形成細胞、真皮成纖維細胞的位置以及營養物質、廢物和藥物的傳輸。右側為皮膚芯片組織切片的蘇木精-伊紅（H&E）染色圖像，比例尺：75微米；(b) 皮膚芯片中，從真皮形成到表皮形成的過程示意圖。
圖5. 免疫熒光圖像顯示皮膚構建中表皮層和真皮層的存在。(a) 表皮層的橫截面，顯示角蛋白10和角蛋白14的表達；(b，c) 真皮層的底部視圖，顯示I型膠原蛋白和IV型膠原蛋白的表達；(d，e) 表皮層的橫截面，顯示外皮蛋白（involucrin）的表達和絲聚合蛋白（filaggrin）的表達，比例尺：75微米。
炎癥是最常見的皮膚疾病之一，影響約25%的人口。為測試皮膚芯片構建炎癥模型并用于藥物檢測的有效性，研究團隊通過使用促炎細胞因子TNF-α在芯片中誘導炎癥，并使用抗炎藥物地塞米松進行治療。地塞米松作為FDA批準的抗炎藥物，能夠有效緩解紅腫、發熱及疼痛。
實驗設置了三種條件：對照組、炎癥組和炎癥+藥物組。對照組使用空白培養基；炎癥組于第二天加入TNF-α，24小時后更換為空白培養基；炎癥+藥物組于第二天加入TNF-α，24小時后更換為地塞米松。研究團隊分別在各個關鍵時間點收集上清液，通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測促炎細胞因子白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）的表達。
為驗證皮膚芯片的準確藥物響應，研究團隊還與2D培養的角質形成細胞和人類皮膚活檢樣本的藥物響應情況進行了對比。2D培養模型對炎癥和地塞米松的敏感性較高，在加入TNF-α后24小時內炎癥急劇上升，TNF-α去除后炎癥立即下降，而地塞米松的加入更加顯著地降低了IL-6和IL-8的水平。相比之下，人類皮膚活檢樣本的反應較慢，TNF-α誘導24小時后炎癥水平上升幅度較小，而在第三天去除TNF-α并換成空白培養基后，炎癥組的炎癥水平卻持續上升；與此同時，炎癥+藥物組的炎癥水平在第三天加入地塞米松后得到了有效控制。通過對比，皮膚芯片與人類皮膚活檢的藥物響應結果相似，在TNF-α誘導的過程中顯示出了相對于2D 培養的延遲炎癥反應，且在加入地塞米松后炎癥水平得到了有效控制（圖6）。
比較三種培養模型的整體趨勢，人類皮膚活檢樣本與我們的皮膚芯片顯示了相似的炎癥和地塞米松治療模式，而2D培養模型則表現出更為劇烈的炎癥波動，形成了顯著不同的藥物響應趨勢。這表明，皮膚芯片模型能夠更準確地預測體內反應，從而提高藥物效力與安全性評估的可靠性。
圖6. 不同培養條件下的相對細胞因子水平變化。在3天的炎癥誘導和藥物處理后檢測不同培養條件下的細胞因子水平：(a, b) 2D培養模型中的相對IL-6和IL-8水平變化；(c, d) 人類皮膚活檢樣本中的相對IL-6和IL-8水平變化；(e, f) 皮膚芯片中的相對IL-6和IL-8水平變化；Control:對照組；TNF-α：僅炎癥組；TNF-α + Dex：炎癥+藥物組。
皮膚活檢樣本在細胞活性和可培養時間上存在較大的批次差異。為評估長期培養中的細胞活性，研究團隊檢測了皮膚芯片、2D培養及人類皮膚活檢樣本上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的表達水平。LDH是檢測細胞損傷或死亡的關鍵指標，LDH水平上升通常表明細胞活性下降或細胞受損。
在2D模型中，LDH水平在培養24小時后有所上升，48小時后略有下降。而人類皮膚活檢樣本的LDH水平逐日遞增，培養48小時后幾乎達到初始水平的3倍之多。相比之下，皮膚芯片展示出了明顯的優勢，其LDH水平在培養24小時后保持穩定，并在培養48小時后顯著下降，顯示出較好的細胞穩定性和長期培養潛力（圖7），因此在長期實驗中更具適用性。
圖7. 在3天培養過程中，不同模型中乳酸脫氫酶（LDH）的表達水平變化。(a,b) 2D單層培養中LDH的表達水平變化；(c,d) 人類皮膚活檢樣本中LDH的表達水平變化；(e,f) 皮膚芯片中的LDH的表達水平變化，LDH水平上升表明細胞活性下降或細胞受損。
本研究開發的皮膚芯片結合了摩方精密的高精度3D打印技術與微流控系統，為藥物與化妝品篩選提供了一個高度準確且具有生理相關性的體外模型。因此，該皮膚芯片通過與更多種類的藥物和活性化合物相結合，有望為未來的生物醫藥和化妝品研究提供更多可能性。
總體而言，該皮膚芯片的開發標志著組織工程與藥物測試技術的重大進展。通過提供一個更精準且用戶友好的模型，使得摩方精密可以實現模擬人類皮膚的真實反應，并在皮膚科、藥理學及化妝品研究中展現出巨大潛力。未來的研究將進一步整合更多類型的細胞，如灌注免疫細胞，以提升模型的應用性，并深入研究皮膚與免疫系統之間的相互作用，這一進展將有望為銀屑病、濕疹及過敏反應等疾病的理解和治療提供新思路。
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